PRÁCTICA 12: DETERMINACIÓN DE COOMBS DIRECTO EN TUBO

OBJETIVO:

Determinar si existen o no anticuerpos irregulares o incompletos fijados en la membrana de los hematíes del paciente enfrentando éstos al reactivo de Coombs específico para ello.

MATERIAL:

- Pipetas automáticas 50 uL/100-1000uL

- Puntas amarillas y azules

- 2 tubos de ensayo de 3 mL

- Gradilla

- Pipetas Pasteur

- Pinzas de metal

APARATAJE:

- Centrífuga

- Visualizador

REACTIVOS:

- AGH y SF.

- Hematíes control sensibilizados con IgG (hematíes reactivos que han sido sensibilizados industrialmente). 

MUESTRA:

- Sangre anticoagulada

PROCEDIMIENTO:

1. Realizar un lavado de los hematíes de la muestra-problema y una dilución al 5%.

2. Depositar de 3 a 4 gotas de AGH en otro tubo pequeño.

3. Situar de 3 a 4 gotas de suspensión de hematíes de la muestra-problema en el tubo junto a la AGH y agitar suavemente.

4. Centrifugar a 2.500 rpm durante 1 minuto.

5. Resuspender el sedimento de hematíes dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo.

6. Observar la presencia o ausencia de aglutinación en el visualizador, y si es necesario, en el microscopio.

RESULTADOS:

Observación macroscópica de la aglutinación:

Ausencia de aglutinación (-): los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.

OBSERVACIONES:

- En el paso 1º echar 1000 uL de SF y 50 uL de sangre.

- En el paso 1º lavar 3 veces.

- En la dilución al 5% echar 500 uL de SF tras centrifugar.

PRÁCTICA 11: DETERMINACIÓN DE COOMBS INDIRECTO

OBJETIVO:

Investigar la presencia de anticuerpos irregulares o incompletos en el suero del paciente enfrentándolos, primeramente, a hematíes específicos tipados y, posteriormente, a la AGH para su detección.

APARATAJE:

- Baño termostático

- Centrífuga

MATERIAL:

- Material para el lavado y la dilución de los hematíes

- Tubos de ensayo 3 mL

- Gradilla

- Pipeta Pasteur y visualizador

REACTIVOS:

- AGH y SF

- Hematíes tipados del grupo O+

MUESTRA:

- Suero problema

PROCEDIMIENTO:

1. Preparación de los hematíes tipados O+

1. Realizar una determinación de grupo celular sobre los hematíes tipados O+ para comprobarlo.

2. Efectuar un lavado y una dilución de los hematíes tipados O+ al 5%.

3. Realizar la prueba de Coombs directa sobre los hematíes tipados O+ para comprobar que no existen anticuerpos irregulares sobre ellos.

2. Determinación de Coombs indirecto

1. En un tubo de hemólisis depositar 2 a 3 gotas del suero problema.

2. Añadir al tubo unas 2 o 3 gotas de la suspensión de hematíes tipados O+ al 5% y agitar suavemente.

3. Incubar la mezcla en un baño termostático durante 15-30 min.

4. Lavar la mezcla con 1 ml de SF.

5. Repetir este lavado 2 veces más.

6. Al sedimento obtenido con el último lavado añadir 2 o 3 gotas de AGH.

7. Centrifugar a 2.500 rmp durante 1 min.

8. Resuspender el sedimento obtenido con el ultimo lavado dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo; si es necesario, añadir unas gotas de SF.

9. Observar la presencia o ausencia de aglutinación en el visualizador, y si es necesario, en el microscopio.

RESULTADOS:

Se observa la presencia de aglutinación: aparecen grumos rojos oscuros que flotan en el líquido.

PRÁCTICA 10: CONFIRMACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO A, B Y D, COMBINADO CON LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

OBJETIVO:

- Identificar y confirmar el grupo sanguíneo ABO y RhD del receptor.

- Verificar la presencia de anticuerpos irregulares con la prueba de Antiglobulina indirecta.

APARATAJE:

- Incubadora

- Centrífuga

MATERIAL:

- Pipetas automáticas 10uL, 25uL, 50uL, 500uL

- Puntas de pipeta amarillas y azules

- Gradilla

- Pipetas Pasteur

- Tubo de ensayo 3 mL

REACTIVOS:

- Tarjeta ID-Card DiaClon Type+Screen

- ID DiaCell I

- ID DiaCell II

- ID DiaCell III

- ID Diluent 2

MUESTRAS:

- Sangre 0+

- Suero o plasma 

PROCEDIMIENTO:

1. Preparación de la muestra de sangre

- Preparar una suspensión de hematíes al 5% en el ID-Diluent 2 como sigue:

1. Pipetear 0,5 mL del ID-Diluent 2 en un tubo limpio.

2. Agregar 50 uL de sangre total y mezclar cuidadosamente.

2. Procedimiento de la prueba

1. Identificar la tarjeta ID-Card con el número o nombre de identificación del donante o del paciente.

2. Retirar la lámina de sellado sólo de los microtubos que se vayan a utilizar manteniendo la tarjeta ID-Card en posición vertical.

3. Pipetear 10 uL de la suspensión de hematíes del paciente en los primeros 3 microtubos (anti-A, anti-B, anti-D) de la tarjeta-ID.

4. Pipetar 50 uL de cada ID-DiaCell I-II-II en los microtubos 4, 5 y 6.

5. Agregar 25 uL de suero del paciente en los microtubos 4, 5 y 6.

6. Incubar la tarjeta ID-Card durante 15 minutos a 37ºC en la incubadora.

7. Centrifugar la tarjeta ID-Card durante 10 minutos en la centrífuga.

8. Leer y anotar las reacciones.

RESULTADOS:

- Positivo: Los hematíes aglutinados forman una línea roja sobre la superficie del gel o están repartidos en el gel.

- Negativo: Sedimento compacto de hematíes en el fondo del microtubo.

En los primeros 3 microtubos podemos observar que son - - +

En los microtubos 4, 5 y 6 son + + -

PRÁCTICA 9: DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO MÁS PROBABLE DEL GRUPO Rh

OBJETIVO:

Investigar el genotipo más probable del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos sueros que contienen anticuerpos dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

FUNDAMENTOS:

El genotipo de una persona es su dotación genética en el cromosoma, y el fenotipo es la manifestación de ese genotipo. 

El fenotipo puede ser idéntico al genotipo.

Dado que no existe el antígeno d, ni el anticuerpo anti-d, es imposible determinar si el antígeno D es homozigoto o heterozigoto mediante su detección en los hematíes. Determinamos el genotipo más probable.

El interés en la determinación del genotipo se debe a que existen casos de madres inmunizadas frente a D, y conviene conocer si el padre es o no homozigoto para D, antes de producrise un nuevo embarazo. Un padre homozigoto D, transmitirá el gen D a todos sus hijos, mientras que uno heterozigoto lo transmitirá con un 50% de probabilidades.

El fenotipo se determina enfrentando los hematíes problema con los antisueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y anti-e.

El genotipo más probable dependerá de la raza o el grupo étnico.

El genotipo del sistema Rh se enfrentan los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh. La existencia o no de estos antígeno en la superficie de los hematíes, se detecta por una reacción de aglutinación. Los resultados se trasladan a una tabla donde vemos los posibles genotipos:

MATERIAL:

- Material para el lavado de hematíes.

- Tubos para centrífuga, Pipetas Pasteur y papel parafilm.

- Gradilla y centrífuga.

- Cubreobjetos y portaobjetos.

REACTIVOS:

- Anti-D (D).

- Anti-E (E).

- Anti-C (C).

- Anti-e (e).

- Anti-c (c).

- Autocontrol D (CD).

- SF

MUESTRA:

-Suspensión de hematíes problema lavados al 5% en SF.

PROCEDIMIENTO:

1. Realizar el lavado de los hematíes de la muestra-problema y una dilución al 5% en SF.

2. Rotular los 6 tubos con las letras D, E, C, e, c y CD.

3. Depositar de 2 a 3 gotas del antisuero correspondiente y de 2 a 3 gotas de la suspensión de hematíes problema.

4. Tapar los tubos con papel parafilm y agitar suavemente.

5. Centrifugar a 1.000 rpm durante 1 minuto.

6. Resuspender el sedimento de hematíes dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo.

7. Observar la presencia o ausencia de aglutinación en el visualizador, y si es necesario, en el microscopio.

RESULTADOS:
Un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscando en ese tubo.

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipos y genotipos del sistema Rh.

La sangre analizada es Rh negativo, se puede determinar su único genotipo posible con respecto al sistema Rh. Sin embargo , si la sangre es Rh positiva, existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

El genotipo posible del sistema Rh en la sangre analizada es: dCe/dcEy dCE/dce