PRÁCTICA 22: REACTIVO SATURANTE-PRECIPITANTE DE CAPACIDAD DE FIJACIÓN TOTAL DEL HIERRO (CFTH)

OBJETIVO: 

- Aprender a determinar la Capacidad Total de Fijación del Hierro (CTFH).

- Determinar el porcentaje de saturación de la transferrina.

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

La transferrina sérica se satura con un exceso de Fe3+ y el exceso no fijado se elimina por precipitación con carbonato magnésico, determinándose a continuación la cantidad total de hierro presente. La diferencia entre la capacidad de fijación total de hierro hallada (CFTH) y el hierro sérico inicial (Hb) nos da la capacidad de fijación de hierro no saturado o residual.

SIGNIFICADO CLÍNICO:
El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado.

El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos.
Encontramos niveles altos de CFTH en la anemia ferropénica.
Niveles bajos en hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda.
El hierro se controla, normalmente, junto con la capacidad de fijación total del hierro (CFTH), y nos indica la capacidad de unión sérica disponible.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS: 

 REACTIVO ADICIONAL:

El sobrenadante obtenido se procesa como muestra para la determinación de hierro.

MATERIAL:

- Gradilla

- Seis tubos de ensayo 

- Pipeta automática de 100-1000 uL
- Puntas azules

- Centrífuga

- Espectrofotómetro

MUESTRAS:

- Plasma heparinizado

PROCEDIMIENTO:

1. Pipetear en los tubos:

2. Mezclar bien e incubar 10 minutos a Temperatura ambiente (15- 25ºC).

3. Añadir a cada tubo:

*Polvo: Medir usando la cuchara que se incluye (dosis aprox. 70 mg).

4. Mezclar bien e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 

5. Centrifugar 15 min. a 3000 r.p.m.

6. Recoger el sobrenadante, cuidadosamente y procesar como una muestra para la determinación de hierro.

7. Proceder de igual manera que en la práctica 21, utilizando el sobrenadante como muestra.

RESULTADO:

((A) Muestra - (A) Blanco de muestra - (A) Blanco de reactivo / (A) Patrón - (A) Blanco de reactivo) x 100 (Concentración Patrón)

(A) Patrón: 0,058

(A) Muestra: 0,107

((A) 0,107 / 0,058) x 100 = 184 μg/dL hierro

CFTH = Concentración de hierro en el sobrenadante x 3 (Factor de dilución)

CFTH = 184 x 3 = 552 μg/dL

Parte de la interpretación se encuentra en el último párrafo del fundamento de la práctica. Los valores de referencia de la CTFH son 200-400 μg/dl, por lo que el resultado obtenido está muy por encima de dichos valores. 
El rango de detección del método va desde los 3 μg/dl a los 1000 μg/dl. Como el resultado ha sido muy superior, y no entra dentro del rango, no es en absoluto fiable. Habría que proceder con una dilución, repitiendo las lecturas y multiplicando por la inversa del factor de la dilución realizada para obtener un resultado fiable.

PRÁCTICA 21: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HIERRO

OBJETIVO:

Determinar de forma cuantitativa la cantidad de hierro presente en la muestra.

PRINCIPIO DEL METODO:

El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil. El hierro libre se reduce a ión ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma un complejo coloreado:

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hierro en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLINICO:

El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado.
El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa anemia ferropénica. Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas.
Estabilidad: 3 meses a 2-8ºC o 1 mes a temperatura ambiente (15-25ºC).
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS:

PREPARACIÓN:

Reactivo de trabajo (RT): 

- Ref: 1001247. Disolver (-->) el contenido de un tubo de R2 Reductor en un frasco de R1 Tampón.

Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.

MATERIAL:

- Gradilla

- Cuatro tubos de ensayo 

- Pipeta automática de 100-1000 uL y de 20-200 uL

- Puntas amarillas y azules
- Espectrofotómetro

MUESTRA:

- Plasma heparinizado

PROCEDIMIENTO:

1. Condiciones del ensayo: 

Longitud de onda:562nm (530-590) 

Cubeta: 1cm paso de luz 

Temperatura: 37ºC / 15- 25ºC

2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

3. Pipetear en una cubeta:

4. Mezclar e incubar 5 min a 37ºC o 10 min a temperatura ambiente.

5. Leer las absorbancias (A) del Patrón y la muestra frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.

RESULTADO:

((A) Muestra - (A) Blanco de muestra - (A) Blanco de reactivo / (A) Patrón - (A) Blanco de reactivo) x 100 (Concentración Patrón)

(A) Patrón: 0,094

(A) Muestra: 0,141 

(0,141/0,094) x 100 = 150 μg/dL

Al tratarse de la muestra de una mujer, se encontraría dentro de los valores de normalidad.

Valor de referencia mujer: 40-150 μg/dL 

PRÁCTICA 20: DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE RETICULOCITOS

OBJETIVOS:

- Determinar el RET por un número determinado de hematíes.

- Calcular el número de reticulocitos existentes por volumen de sangre.

- Valorar el RET, el número absoluto de reticulocitos y de la actividad eritropoyética.

FUNDAMENTO: 

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen restos de ARN ribosomial, el cual se tiñe por determinados colorantes llamados ``vitales´, precipitando y observando unos filamentos o citoplasmáticos que no poseen los hematíes. Según el grado de maduración presentan más o menos filamentos, de forma que a más maduros menos filamentos.

Esta práctica se realiza para saber el porcentaje % de reticulocitos que hay circulantes en sangre.

Los reticulocitos son las células de la última línea de la eritropoyesis de los hematíes.

MATERIAL:

- Gradilla

- Tubo de ensayo

- Lanceta

- Toallita con alcohol

- Papel parafilm

- Tres pipetas Pasteur desechables 

- Dos portaobjetos

- Microscopio y aceite de inmersión

REACTIVOS:

- Colorante de azul de cresil brillante preparado de la siguiente manera:

 - 1 volumen de citrato sódico (20 mL)

 - 4 volúmenes de solución salina (9g/1 de ClNa, suero fisiológico, 80 mL)

 - 1 g de azul de cresil brillante

- Disolver el colorante en a mezcla anterior, guardarlo en una botella de cristal topacio para que no se vea afectado por La Luz, y filtrarlo antes de usarlo. Generalmente, las marcas comerciales ya suministran el colorante preparado para su uso.

MUESTRA:

- Sangre anticuoagulada 

PROCEDIMIENTO:

1. Colocar en un tubo pequeño 3 gotas de solución de colorante con una Pipeta Pasteur. 

2. Añadir 3 gotas de muestra sanguínea con la ayuda de una Pipeta Pasteur.

3. La mezcla siempre debe ser proporcional 1:1 (la misma cantidad de colorante que de muestra).

4. Tapar el tubo donde se ha realizado la mezcla con parafilm.

5. Mezclar agitando suavemente para que los eritrocitos absorban bien el colorante.

6. Dejar en reposo a temperatura ambiente unos 20 minutos.

7. Pasado este tiempo, volver a homogeneizar la suspensión.

8. Destapar el tubo; con una gota de la mezcla, efectuar una extensión sobre el portaobjetos.

9. Dejar secar la extensión al aire.

10. Colocar la extensión ya bien seca sobre la platina del microscopio.

11. Con el objetivo de 40x localizar una zona de la extensión en que los hematíes se observen bien separados.

12. Pasar al objetivo de 100x y ajustar la luminosidad para observar bien las células.

13. Hacer un recorrido de diferentes campos sobre la extensión en forma de almena hasta llegar a observar varios reticulocitos.

RESULTADO:

En esta imagen podemos observar claramente un reticulocito. Este campo está observado con el objetivo de 100x.

Campos - Hematíes contados - Reticulocitos observados

    1                    260                                    3
    2                    230                                    2
TOTAL               490                                    6
Se observaron dos campos, contando todos los hematíes presentes en él. En total se contabilizaron 490 hematíes, de los cuales 6 fueron identificados como reticulocitos.

Con los datos anteriores, calculamos el porcentaje:

(6/490) x 100 = 1,22%

Los valores son normales. Entre 1% y 1,9% normal. Si sobrepasa el 2%, implicaría existencia de una reticulocitosis típica de una anemia regenerativa. Si el valor se encuentra inferior al 0,5% implica la existencia de una reticulopenia típica de una anemia arregenerativa.

PRÁCTICA 19: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA

OBJETIVO:

Determinar la concentración de hemoglobina en la muestra.

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cloruro se convierte en cianmetahemoglobina.

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.

Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitudEl diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS:

- Hemoglobin 50x: Ferricianuro de potasio, cianuro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio.

- Hemoglobin CAL: Patrón de hemoglobina 15g/dL, origen animal

APARATAJE:

- Espectrofotómetro

MUESTRA:

- Sangre capilar

MATERIAL:

- Gradilla

- Tubos de ensayo 10 mL

- Pipetas automáticas 20-200 uL/ 5000 uL

- Puntas amarillas y blancas

- Vaso precipitado con agua destilada

- Lancetas

- Alcohol 96º

- Papel 

- Cubetas de espectrofotometría

PROCEDIMIENTO:

- Condiciones de ensayo:

Longitud de onda: 540 nm

Cubeta: 1 cm paso de luz

Temperatura: 15-25ºC

1. Coger 3 tubos de ensayo de 10 mL (Marcar con B, P y M).

2. Echar en cada tubo 4,9 mL de agua destilada + 2 gotas de Reactivo (hemoglobin 50x)

3. En tubo P (Patrón), echar 20 uL de hemoglobin CAL.

4. En tubo M (Muestra), echar 20 uL de sangre (con la pipeta automática). 

5. Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente.

6. Leer la absorbancia, del Patrón o Calibrador y Muestra, frente al Blanco de Reactivo.

RESULTADO:

Dividir el resultado de la absorbancia de la Muestra entre la absorbancia del Patrón. Multiplicar por 15 (Con. Patrón).

(A) 0,381 / (A) 0,420 x 15 = 13,6 g/dL

(A) Patrón

(A) Muestra

PRÁCTICA 18: DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA PEROXIDASA EN LEUCOCITOS

Kit de reactivos citoquímicos para diagnóstico de la leucemia

El presente kit de “LEUCOGNOST® POX - Detección de la reacción de la peroxidasa en leucocitos” es utilizado para el diagnóstico celular en la medicina humana, se emplea en el examen hematológico y citológico de muestras de origen humano. Se trata de un kit de tinción que, junto con otros materiales de diagnóstico in vitro pertenecientes a nuestra cartera, hace evaluables determinadas para el diagnóstico estructuras de destino (mediante fijación, tinción, dado el caso contratinción, montaje) en material de examen hematológico y clínico-citológico, como p.ej. frotis de sangre total y de médula ósea.

El presente kit de tinción está previsto para la reacción en la cubeta de 60 ml de Hellendahl y contiene todos los reactivos necesarios para detección de la reacción de la peroxidasa en leucocitos.

PRINCIPIO:

La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquimicamente signifi- cativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca.

Las peroxidasas son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cangerígena, aqui: 4-cloro- 1-naftol) a un peróxido (aquí: peróxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y se transforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse corno indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas.

MATERIAL:

- Frotis frescos de sangre

- Alcohol 96º

- Papel 

- Portaobjetos 

- Lanceta

- Pipeta Pasteur

- Pinzas

REACTIVOS:

El kit contiene 14 frescos 

- R1: 4-Cloro-1-naftol

- R2: Tris (hidroximetil) aminometano HCl solución tampón

- R3: Solución de peróxido de hidrógeno

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS:

Se necesitan frotis sanguíneos finos, secados al aires y guardados como máximo durante 3 días.

Los frotis han de ser secados al aire durante 30 minutos como mínimo, debiéndose fijar éstos antes de la reacción citoquímica propiamente dicha según las correspondientes prescripciones.

Después de la fijación los frotis podrán ser almacenados hasta 3 días en el frigorífico.

Todas las muestras deben tratarse de acuerdo con el estado de la tecnología. Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS:

Preparación de solución de tinción 

Utilizar solamente soluciones recién preparadas

Para preparar aprox. 60 ml de solución se añaden juntos:

La solución de tinción preparada es incolora y utilizable durante 3 horas.

TÉCNICA:

Los portaobjetos han de ser inmersos y movidos brevemente en las soluciones, la simple introducción proporcionará resultados de tinción insuficientes.

Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de soluciones.

Para el almacenamiento de preparados hematológicos durante varios meses se recomienda el montaje con un medio de montaje acuoso (p.ej. Aquatex®) y un cubreobjetos. Sin montaje, la tinción tendrá una estabilidad de unos 3 días; si se cubre con aceite de inmersión, la estabilidad será de sólo unas horas.

Para el análisis de preparados teñidos con un aumento microscópico >40x se recomienda el uso de aceite de inmersión.

RESULTADO:

Los neutrófilos y eosinófilos son peroxidasa-positivas, se ven claramente gránulos con tinción pardo-negruzca.