PRÁCTICA 19: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA

OBJETIVO:

Determinar la concentración de hemoglobina en la muestra.

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cloruro se convierte en cianmetahemoglobina.

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.

Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitudEl diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS:

- Hemoglobin 50x: Ferricianuro de potasio, cianuro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio.

- Hemoglobin CAL: Patrón de hemoglobina 15g/dL, origen animal

APARATAJE:

- Espectrofotómetro

MUESTRA:

- Sangre capilar

MATERIAL:

- Gradilla

- Tubos de ensayo 10 mL

- Pipetas automáticas 20-200 uL/ 5000 uL

- Puntas amarillas y blancas

- Vaso precipitado con agua destilada

- Lancetas

- Alcohol 96º

- Papel 

- Cubetas de espectrofotometría

PROCEDIMIENTO:

- Condiciones de ensayo:

Longitud de onda: 540 nm

Cubeta: 1 cm paso de luz

Temperatura: 15-25ºC

1. Coger 3 tubos de ensayo de 10 mL (Marcar con B, P y M).

2. Echar en cada tubo 4,9 mL de agua destilada + 2 gotas de Reactivo (hemoglobin 50x)

3. En tubo P (Patrón), echar 20 uL de hemoglobin CAL.

4. En tubo M (Muestra), echar 20 uL de sangre (con la pipeta automática). 

5. Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente.

6. Leer la absorbancia, del Patrón o Calibrador y Muestra, frente al Blanco de Reactivo.

RESULTADO:

Dividir el resultado de la absorbancia de la Muestra entre la absorbancia del Patrón. Multiplicar por 15 (Con. Patrón).

(A) 0,381 / (A) 0,420 x 15 = 13,6 g/dL

(A) Patrón

(A) Muestra